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擁有獨(dú)立的PCR實(shí)驗(yàn)室、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室、微生物實(shí)驗(yàn)室

自動(dòng)化工作站適配實(shí)驗(yàn)室等

能夠進(jìn)行一站式的耗材、試劑、儀器的

生物學(xué)性能驗(yàn)證與整合研發(fā)

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給大家分享PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)及問(wèn)題解決方案

樣本采集和保存

良好的樣品采集和保存方法對(duì)于DNA提取的成敗至關(guān)重要，尤其對(duì)于珍貴樣品的采集和保存的方式更是需要特別小心和關(guān)注。

大部分情況下應(yīng)盡可能使用新鮮制備的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以期獲得最好的結(jié)果。但客觀情況是剛采集的組織樣品是不能馬上進(jìn)行DNA提取，短期內(nèi)保存運(yùn)輸可以置于-20℃~0℃，長(zhǎng)期保存可直接通過(guò)液氮速凍并置于-80℃保存半年。

DNA提取純化

該方案是用酚類試劑變性蛋白質(zhì)，來(lái)對(duì)樣本進(jìn)行裂解，后用苯酚/氯仿抽提，再無(wú)水乙醇沉淀。氯仿的作用是去除多余的酚，促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離。該提取方法需要多次離心，步驟較為繁瑣，易造成交叉污染。另外，由于終產(chǎn)物中會(huì)引入苯酚/氯仿等有機(jī)溶劑殘留，對(duì)后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)可能會(huì)有抑制。

是通過(guò)加入各種蛋白酶去除蛋白雜質(zhì)，從而分離DNA，有效避免試劑的污染，以獲得高產(chǎn)量和高純度的DNA，但缺點(diǎn)是消解蛋白酶的過(guò)程費(fèi)時(shí)較多，且純度不穩(wěn)定。

該方案是將 DNA 分子中的磷酸二酯骨架在離液鹽作用下脫水后，使得磷酸基團(tuán)暴露的同時(shí)與硅膠發(fā)生可逆性吸附。硅介質(zhì)吸附純化法可以通過(guò)離心以及真空加壓的方法使裂解液穿過(guò)濾膜，可以有效的提取微量的 DNA。靜電力和氫鍵在硅膠與核酸的吸附中起著關(guān)鍵作用。該方法在脫氧核糖核酸的鏈長(zhǎng)上有一定限制，較小的 DNA 片段(<100 bp)不容易在介質(zhì)上得到有效吸附。

該方法將純化介質(zhì)包被在納米級(jí)的磁珠表面，通過(guò)介質(zhì)對(duì)DNA的吸附，在外加磁場(chǎng)的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動(dòng)，從而達(dá)到核酸與其它物質(zhì)分離的目的。

與其它的方法相比，磁珠法有以下優(yōu)勢(shì)：

l  分離快：磁場(chǎng)分離只需幾秒鐘；

l  提取靈敏度高：微量的樣本也可純化分離；

l  純化純度高：核酸與雜質(zhì)分離完全；

l  提取產(chǎn)量高：每毫克磁珠能吸附500 μg左右的DNA；

l  高通量提?。嚎赏瑫r(shí)完成數(shù)百個(gè)樣品的提取；

l  環(huán)保無(wú)毒：提取方案不含有毒成分。

PCR擴(kuò)增

PCR，又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，基本原理類似于 DNA 的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。該技術(shù)可以從被稱為模板DNA的混合物中擴(kuò)增出一個(gè)高數(shù)量級(jí)特定的目標(biāo)DNA片段。模板來(lái)源有很多種，除了如上述講到的從細(xì)胞提取基因組DNA外，還有從RNA逆轉(zhuǎn)錄來(lái)的cDNA等。

一個(gè)PCR反應(yīng)需要包含以下組分：DNA模板、上下游引物、dNTPs、反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶等，而通常商業(yè)化的試劑會(huì)將除DNA模板和上下游引物以外的組分全部預(yù)混，以方便科研使用。PCR實(shí)驗(yàn)最需要注意的是做好引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)程序的設(shè)置，一般引物設(shè)計(jì)通過(guò)Premier 5或NCBI在線設(shè)計(jì)等平臺(tái)來(lái)設(shè)計(jì)。

引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

l  引物 3’端最后一個(gè)堿基選擇 C 或 G；

l  引物 3’端最后 8 個(gè)堿基應(yīng)避免出現(xiàn)連續(xù)錯(cuò)配；

l  引物 3’端盡量避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)；

l  引物 Tm 值控制在 55℃-65℃之間；

l  引物額外附加序列，即與模板非配對(duì)序列，不應(yīng)參與引物 Tm 值計(jì)算；

l  引物 GC 含量控制在 40%-60%之間；

l  正向引物和反向引物 Tm 值以及 GC 含量盡可能一致。

PCR產(chǎn)物鑒定與純化

PCR產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來(lái)鑒定產(chǎn)物的質(zhì)量，包括得到片段的長(zhǎng)度、產(chǎn)量、特異性等。

l  跑膠的目的條帶可以通過(guò)DNA膠回收試劑盒來(lái)回收目標(biāo)DNA；

l  PCR反應(yīng)產(chǎn)物也可直接通過(guò)PCR產(chǎn)物清潔回收試劑盒進(jìn)行純化，以用于下游實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步對(duì)于想要獲得產(chǎn)物DNA堿基序列詳細(xì)信息，可將樣本送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

PCR優(yōu)化思路

你送出去設(shè)計(jì)合成引物的公司會(huì)在說(shuō)明書上提供你的寡核苷酸引物的 Tm，但是我們發(fā)現(xiàn)不同的公司根據(jù)他們采用的計(jì)算方式所提供的 Tm明顯不一樣。這邊推薦IDT website的引物設(shè)計(jì)工具OligoAnalyzer在優(yōu)化退火溫度方面非常好用，Tm計(jì)算公式如下：

Tm= 2(A+T) + 4(G+C)

其中 A, T, G和C表示你的引物序列中對(duì)應(yīng)的堿基數(shù)

Tm與緩沖液的鹽濃度、pH值以及引物濃度有關(guān)，但是一般人很少去考慮這些。大部分人會(huì)告訴你，為了防止引物二聚體的形成，推薦你退火溫度要比Tm值至少高到10℃。OligoAnalyzer工具在設(shè)計(jì)引物時(shí)也會(huì)考慮到模板DNA的二聚體結(jié)構(gòu)。但是我建議退火溫度設(shè)定值比你兩個(gè)引物最低的Tm低3℃。例如，如果你的前置引物Tm是62℃，后置引物Tm是61℃，那么設(shè)定它們的退火溫度為58℃。

如果你擁有一臺(tái)具有梯度擴(kuò)增功能的PCR儀，同時(shí)具有足夠量的模板，你可以進(jìn)行兩到三次的重復(fù)試驗(yàn)。我建議設(shè)定一定范圍的退火溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并評(píng)估每個(gè)溫度效果。

你曾經(jīng)有沒(méi)有想過(guò)到底是誰(shuí)想出PCR反應(yīng)的條件和方法，使得變性和退火時(shí)間一直以來(lái)都保持一致，只有延伸時(shí)間可根據(jù)你擴(kuò)增大小進(jìn)行調(diào)整。一般的經(jīng)驗(yàn)法則是你每擴(kuò)增1 kb需要60秒的延伸時(shí)間（根據(jù)你選用的聚合酶的效率）。例如，如果你擴(kuò)增一個(gè)2 kb的片段，你需設(shè)計(jì)120秒的延伸時(shí)間。對(duì)于較短的產(chǎn)物，縮短延伸時(shí)間。對(duì)于一個(gè)200 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，15到20秒的延伸時(shí)間是足夠的。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引入不必要的非特異性的PCR產(chǎn)物！

Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中用的最多，尤其在驗(yàn)證目的基因的PCR擴(kuò)增中。Pyrococcusfuriosus(PFU)聚合酶則廣泛應(yīng)用于高保真的PCR反應(yīng)中。

但是也有一些其他的聚合酶對(duì)不同的模板有著不一樣的擴(kuò)增效率。比如：如果你的擴(kuò)增模板中含有較高的GC含量（超過(guò)65%），Thermo Scientific的 Accuprime G-C Rich DNA Polymerase擴(kuò)增的效果將會(huì)更好！

當(dāng)你購(gòu)買一管DNA聚合酶時(shí)，包裝里會(huì)配備一管已經(jīng)優(yōu)化好的Buffer。正常來(lái)說(shuō)，安裝說(shuō)明書進(jìn)行操作是不會(huì)錯(cuò)的。但是我們認(rèn)為作為一個(gè)科研人，了解Buffer組分和濃度對(duì)PCR效率的影響很有必要。因?yàn)榇蟛糠諦uffer只是簡(jiǎn)單地在某個(gè)pH值下進(jìn)行鹽離子（KCl和MgCl2）的混合。

可以調(diào)整鎂離子濃度來(lái)改變PCR的效率和保真度。對(duì)Taq DNA polymerase，優(yōu)化的鎂離子濃度是1.5到2 mM，因?yàn)槠渌木彌_液和反應(yīng)所需的組分有可能會(huì)對(duì)鎂離子產(chǎn)生螯合作用，從而需要增加鎂離子濃度。最終在設(shè)定鎂離子濃度時(shí)，會(huì)作一個(gè)小調(diào)整（大約增加0.5 mM）

包括引物長(zhǎng)度、GC含量、Tm值、二聚體等等……在這里簡(jiǎn)單地介紹優(yōu)化引物濃度。如果添加過(guò)多的引物，會(huì)增加非特異性結(jié)合和引物二聚體。我們認(rèn)為引物濃度推薦設(shè)定為1μM的較低水平效果會(huì)好很多。為了提高特異性，引物濃度甚至可以降到0.1 μM，但是可能會(huì)減低PCR產(chǎn)量。

dNTPs的濃度不僅會(huì)影響PCR的特異性也會(huì)影響產(chǎn)量。 太高濃度的dNTP將會(huì)降低特異性，太低有可能降低產(chǎn)量。

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